quinta-feira, 1 de março de 2018

Aula teórica 2- Bactérias fitopatogênicas

Olá pessoal,

Na aula dessa semana passada vocês conheceram as características das bactérias fitopatogênicas.

Características gerais das bactérias

São seres unicelulares, aparentemente simples, sem carioteca, ou seja, sem membrana delimitante do núcleo. Ha um único compartimento, o citoplasma.
-  O material hereditário, uma longa molécula de DNA, está enovelada na região, aproximadamente central, sem qualquer separação do resto do conteúdo citoplasmático. Suas paredes celulares, quase sempre, contém o polissacarídeo complexo peptideoglicano.
Usualmente se dividem por fissão binaria. Durante este processo, o DNA é duplicado e a célula se divide em duas.

Tamanho

Invisíveis a olho nu, só podendo ser visualizada com o auxílio do microscópio, as bactérias são normalmente medidas em micrômetros (μm), que são equivalentes a 1/1000mm (10-3mm). As células bacterianas variam de tamanho dependendo da espécie, mas a maioria tem aproximadamente de 0,5 a 1μm de diâmetro ou largura.

Morfologia

Há uma grande variedade de tipos de bactérias e suas formas variam, dependendo do gênero da bactéria e das condições em que elas se encontram.
Apresentam uma das três formas básicas: cocos, bacilos e espirilos.

- Cocos: são células geralmente arredondadas, mas podem ser ovoides ou achatadas em um dos lados quando estão aderidas a outras células.

Os cocos quando se dividem para se reproduzir, podem permanecer unidos uns aos outros, o que os classificam em: diplococos, estreptococos, tetrades, estafilocos, sarcinas. Vejam a figura abaixo.

Visualização da classificação dos cocos

- Bacilos: são células cilíndricas ou em forma de bastão. Existem diferenças consideráveis em comprimento e largura entre as várias espécies de bacilos. As porções terminais de alguns bacilos são quadradas, outras arredondadas e, ainda, outras são afiladas ou pontiagudas.

- Espirilos: são células espiraladas ou helicoidais assemelhando-se a um saca-rolha.

Estruturas bacterianas

Com a ajuda do microscópio, podemos observar uma diversidade de estruturas, funcionando juntas numa célula bacteriana. Algumas dessas estruturas são encontradas externamente fixadas a parede celular, enquanto outras são internas. A parede celular e a membrana citoplasmática são comuns a todas as células bacterianas.

Vejam, de forma esquemática, as estruturas de uma célula bacteriana:




Membrana citoplasmática

Localiza-se imediatamente abaixo da parede celular. A membrana citoplasmática e o local onde ocorre a atividade enzimática e do transporte de moléculas para dentro e para fora da célula. E muito mais seletiva a passagem de substancias externas que a parede celular.

Parede celular

A parede celular e uma estrutura rígida que mantem a forma característica de cada célula bacteriana. A estrutura é tão rígida que mesmo altas pressões ou condições físicas adversas raramente mudam a forma das células bacterianas. E essencial para o crescimento é divisão da célula. 
As paredes celulares das células bacterianas não são estruturas homogêneas, apresentam camadas de diferentes substancias que variam de acordo com o tipo de bactéria. Elas diferem em espessura e em composição. Além de dar forma a bactéria, a parede celular serve como barreira para algumas substancias, previne a evasão de certas enzimas, assim como a entrada de certas substancias químicas e enzimas indesejáveis, que poderiam causar danos a célula. Nutrientes líquidos necessários a célula tem passagem permitida.

Estruturas externas a parede celular

Cápsula

É um envoltório externo a membrana plasmática que ajuda a proteger a superfície celular contra lesões mecânicas e químicas. E composto de moléculas de açúcar associadas aos fosfolipídios e as proteínas dessa membrana. O glicocálice bacteriano e um polímero viscoso e gelatinoso que está situado externamente a parede celular. Na maioria dos casos, ele e produzido dentro da célula e excretado para a superfície celular. Em certas espécies, as cápsulas são importantes no potencial no desenvolvimento de doenças bacterianas (fator de virulência). As cápsulas, frequentemente, protegem as bactérias patogênicas da fagocitose pelas células do hospedeiro.

Flagelos e cílios

Flagelo significa chicote – longo apêndice filamentoso que serve para locomoção. Se as projeções são poucas e longas em relação ao tamanho da célula, são denominados flagelos. Se as projeções são numerosas e curtas lembrando pelos sãos denominados cílios.
Existem quatro tipos de arranjos de flagelos, que são:

• Monotríquio (um único flagelo polar).
• Anfitríquio (um único flagelo em cada extremidade da célula).
• Lofotríquio (dois ou mais flagelos em cada extremidade da célula).
• Peritríquio (flagelos distribuídos por toda célula).

 As bactérias móveis contem receptores em várias localizações, como dentro ou logo abaixo da parede celular. Estes receptores captam os estímulos químicos, como o oxigênio, a ribose e a galactose. Em resposta aos estímulos, a informação e passada para os flagelos. Se um sinal quimiotático (estimulo químico) e positivo, denominado atraente, as bactérias se movem em direção ao estimulo com muitas corridas e poucos desvios. Se um sinal e negativo, denominado repelente, a frequência de desvios aumenta à medida que a bactéria se move para longe do estimulo. As bactérias patogênicas flageladas são consideradas mais virulentas que as não flageladas.

Fimbrias e pili

São apêndices semelhantes a pelos mais curtos, mais retos e mais finos que os flagelos, são usados para fixação em vez de motilidade. Essas estruturas, que distribuídas de modo helicoidal em torno de um eixo central, são divididas em fímbrias e pili, possuindo funções diversas. As fímbrias permitem as células aderir as superfícies, incluindo as de outras células. Os pili (singular pilus), normalmente, são mais longos que as fímbrias, havendo apenas um ou dois por célula. Os pili unem-se as células bacterianas na preparação para transferência de DNA de uma célula para outra.

Material genético

Contém uma única molécula circular longa de DNA de dupla fita, o cromossomo bacteriano. E a formação genética da célula que transporta toda informação necessária para as estruturas e as funções celulares.

Plasmídeos

São moléculas de DNA de dupla fita pequenas e circulares. Não estão conectados ao cromossomo bacteriano principal e replicam-se, independentemente, do DNA cromossômico. Podem ser ganhos ou perdidos sem lesar a celular e transferidos de uma bactéria para outra. Podem transportar genes para atividades como a resistência aos antibióticos, tolerância aos metais tóxicos, produção de toxinas e síntese de enzimas. Quanto mais alto o peso molecular maior será sua importância. Cada plasmídeo tem uma função própria, os que não tem função são crípticos e apresentam baixo peso molecular.

Ribossomos

Servem como locais de síntese proteica. São compostos de duas subunidades, cada qual consistindo de proteínas e de um tipo de RNA denominado ribossômico (RNAr). Os ribossomos procarióticos diferem dos eucarióticos no número de proteínas e de moléculas de RNA. Devido a essa diferença, a célula microbiana pode ser morta pelo antibiótico, enquanto a célula do hospedeiro eucariótico permanece intacta.

Reprodução

Quando os microrganismos estão em um meio apropriado (alimentos, meios de cultura, tecidos de animais ou plantas) e em condições ótimas para o crescimento, um grande aumento no número de células ocorre em um período de tempo relativamente curto. A reprodução das bactérias se dá, principalmente, de forma assexuada, em que novas células iguais a que deu origem são produzidas. As bactérias se reproduzem assexuadamente por fissão binaria, na qual uma única célula parental simplesmente se divide em duas células filhas idênticas. Anteriormente a divisão celular, os conteúdos celulares se duplicam e o núcleo e replicado.

Reprodução dos procariotos

O tempo de geração, ou seja, o intervalo de tempo requerido para que cada microrganismo se divida ou para que a população de uma cultura duplique em número é diferente para cada espécie e é fortemente influenciado pela composição nutricional do meio em que o microrganismo se encontra.
Alguns procariotos se reproduzem assexuadamente por modelos de divisão celular diferentes da fissão binaria, tais como:

 Brotamento – a célula-mãe expele, de forma lenta, uma célula-filha que brota de maneira a originar uma nova bactéria. As células-filhas podem se manter agregadas as células-mães, após sucessivos brotamentos forma-se uma colônia.

 Fragmentação – formação de filamentos, cada um deles inicia o crescimento de uma nova célula.

Mecanismos de variabilidade


1- Conjugação: É a transferência direta de genes de uma célula bacteriana a outra, mediada por um tipo especial de plasmídeo, os chamados plasmídeos de conjugação (pilus).


                         Conjugação em bactérias

2- Transformação: É a incorporação, ao genoma da bactéria, de um fragmento de DNA livremente no ambiente. Esse fragmento de DNA livre no ambiente pode vir de bactérias mortas, por exemplo.

Transformação em bactérias

3- Transdução: Entende-se por transdução a transferência de um fragmento de DNA de uma bactéria a outra por intermédio de bacteriófagos. Bacteriófagos, ou mais simplismente fagos, são vírus que infectam bactérias.

Transdução em bactérias

Curva de crescimento

O crescimento dos microrganismos descreve uma curva caracterizada por quatro fases: latência (lag), exponencial (log), estacionaria e morte ou destruição. As bactérias se reproduzem via progressão geométrica (n2), por isso a expressão e representada em logaritmo (log) do número de microrganismo pelo tempo gasto para a multiplicação, isto e crescimento exponencial por ter uma célula originando 2 que por sua vez originam 4 e, assim, sucessivamente.

Gráfico da curva de crescimento

As bactérias se reproduzem via progressão geométrica (2n)
 O tempo de geração das bactérias ocorre num intervalo entre 7-30 minutos.

AB = fase de latência
BC = fase logarítmica
CD = fase estacionaria
DE = fase de destruição ou morte

Fase de latência (lag)- É caracterizada pela adaptação da célula do microrganismo ao novo meio, quer seja através da inoculação ou contaminação. Esta fase e influenciada pela idade da cultura, quantidade de inoculo bacteriano, tipo de microrganismo, características do alimento e meio ambiente (pH, oxigênio, composição do meio, substancias inibidoras, etc.)

Fase logarítmica (log)- É caracterizada pelo crescimento acelerado e a predominância de células jovens que apresentam seu máximo potencial metabólico. Com o aumento populacional poderá haver esgotamento de nutrientes e/ou alta concentração de metabolitos tóxicos que limitara a multiplicação, pondo fim a fase de crescimento exponencial, ou seja, a fase logarítmica.

Fase estacionária- É caracterizada por células velhas, mais resistentes a condições adversas, podendo em alguns casos se esporular. Nessa fase, o número de células viáveis e igual ao número de células inviáveis.

Fase de destruição- Com o aumento da adversidade do meio, essas células morrem em ritmo acelerado (fase de declínio, destruição ou morte), dando fim ao ciclo microbiano.

Sintomas característicos em plantas infectadas por fitobactérias:


 Anasarca ou encharcamento

  Cancro

  Murcha bacteriana

  Galha em roseira

  Goma em tomateiro

  Mancha foliar em videira

Podridão mole em pimentão

Aula prática 1- Gama de hospedeira

Olá pessoal,

Na aula prática vocês acompanharam o teste de gama de hospedeiro como ferramenta para diagnose de viroses em plantas.

Esse teste consistiu na inoculação do vírus em uma série de espécies de plantas, ditas indicadoras, e na observação e registro posteriores dos sintomas induzidos pelo vírus em cada uma delas. O diagnóstico é feito com base em comparação dos sintomas observados com aqueles relatados na literatura.

Vantagens do método:

-Resultados bastante precisos
-Custo reduzido
-Avalia infectividade

Desvantagem do método:

-Está sujeito à variabilidade intrínseca ao vírus, ao ambiente e ao hospedeiro
-Funciona apenas para vírus transmitido mecanicamente
-Resultados mais demorados
-Demanda espaço
                        
Vocês transmitiram os vírus mecanicamente nas plantas indicadoras. O abrasivo (Carborundum 600 mesh) foi utilizado para produzir microferimento no tecido das plantas para facilitar a entrada do vírus na célula vegetal. Folhas sintomáticas foram depositadas dentro de um cadinho contendo tampão fosfato e posteriormente maceradas até obtenção do extrato vegetal.

Materiais utilizados na transmissão

...vocês lembram? O tampão fosfato serve para manter a integridade das partículas virais ...

Vocês esfregaram levemente o extrato com o abrasivo na superfície foliar e depois de alguns minutos lavaram a superfície foliar com água.

Folhas de abobrinha sintomáticas dentro da placa de Petri e folhas de fumo com o vírus do mosaico do fumo (TMV)


Transmissão mecânica com o extrato da folha sintomática


Lavagem das folhas após inoculação


Exemplo de plantas indicadoras que podem ser utilizadas no teste:

- Fumo (Nicotiana tabacum)
- Datura
- Tomate
- Feijão preto
- Fumo (Para TMV) – Vírus do mosaico do fumo (TMV)
- Pepino – Vírus da abobrinha
- Abobrinha - Vírus da abobrinha

Indicadoras: Fumo, Datura, tomate, feijão preto e fumo (para TMV)

Indicadoras: abobrinha e o pepino


A abobrinha e o pepino foram inoculados com o vírus da abobrinha. O fumo, Datura, tomate, feijão preto e fumo (para TMV) foram inoculados com o vírus do mosaico do fumo (TMV). As plantas irão ficar dentro da casa-de-vegetação para vocês avaliarem os sintomas !
Plantas armazenadas na casa-de-vegetação


Lembrem-se: Observem os sintomas semanalmente e anotem as observações na apostila.

domingo, 25 de fevereiro de 2018

Aula teórica 1- Virologia vegetal e viroides

Olá pessoal,

Na aula de segunda-feira vocês puderam acompanhar as características e comportamento dos vírus e viróides que causam doenças em plantas.

... Vocês lembram ?!  A partícula viral é submicroscópica, ou seja, ela é muuuuuito pequena, apenas conseguimos visualizá-las por meio de um microscópio eletrônico...

Os vírus são constituídos de proteínas e ácido nucléico (RNA ou DNA) ... lembrem-se: um vírus nunca tem os dois tipos de ácidos nucleicos! A maioria dos vírus de plantas possuem RNA como material genético. O ácido nucléico é revestido por uma “capa” protetora (o capsídeo), constituída de moléculas de proteínas (as subunidades).

Constituintes de uma partícula viral


CURIOSIDADE: Alguns vírus de plantas possuem lipídios, glicoproteínas e até membranas como constituintes (p.ex. o Tomato spotted wilt virus, TSWV).

Vocês viram a variedade de sintomas decorrente da infecção viral. Vejam alguns exemplos :

-Bronzeamento na folha da videira - Closterovírus


-Mancha anelar do mamoeiro (PRSV-P)


-Lesões aneladas e cloróticas em folhas de citros - CiLV


-Lesões cloróticas em folha de C. quinoa - BYMV


-Mancha café em sementes de soja - VMCS


-Variegação em flores de wallflower Erysimum -TuMV


-Lesões locais em N. tabacum - ToRSV


-Manchas em tomate - TSWV


-Mosaico em folhas de fumo - TMV



CUIDADO: Outros fatores de sintomas semelhantes aos de infecção por vírus:

                    - Deficiência nutricional
                    - Toxinas produzidas por insetos
                    - Distúrbios
                    - Toxidez por inseticidas ou herbicidas
                    - Alta temperatura

CURIOSIDADE: Na Holanda, no século XVII, tornaram-se famosos os produtores de tulipas variegadas. Bulbos de tulipas eram negociados a preços absurdamente altos. A variegação era o sintoma decorrente da infecção de um vírus. Essa variegação era muito apreciada na época, tanto é que em uma exposição realizada em 1656, um único bulbo foi vendido pelo seguinte preço: 4 toneladas de trigo, 8 toneladas de cevada (da pra fazer muita cerveja :D), 4 bois gordos (o churrasco está garantido!), 4 barris de cerveja (mais cerveja !!!) , 2 barris de manteiga, 450 kg de queijo, uma cama, um armário e uma pulseira de prata! Essa soma foi paga por um bulbo infectado pelo Tulip breaking virus, embora na época esse fato não fosse conhecido. Hoje, cultivam-se tulipas cuja variegação tem origem genética.


Variegação em tulipas com TBV


Eu sei ... nomenclatura sempre parece bastante difícil, mas para vírus não é ... vejam:

  •  O nome científico sempre deve estar em inglês
  •  1º nome do hospedeiro
  •  2º nome do sintoma típico
  • 3º nome “virus”

 Vejam este exemplo:

Tobacco masaic virus -TMV (Vírus do mosaico do fumo)

         Tobacco                               mosaic               virus
(Hospedeiro = Tabaco)       ( Sintoma: Mosaico)     (Virus)

Como os vírus se multiplicam na planta?

Para vírus utilizamos a palavra replicação. Vamos recordar o que isso significa !
Replicação consiste na duplicação do ácido nucléico, tendo por base um molde pré-existente.

Algumas eventos estão envolvidas na replicação viral. Vejam esses eventos na figura abaixo:


1- Penetração: Introdução da partícula viral ou de seu ácido nucléico na célula vegetal (por ex. Vetores, ferimentos) 

2- Desnudamento: Liberação do ácido nucléico no interior da célula pela desmontagem do capsídeo.

3- Síntese de componentes virais: ácido nucléico livre comanda o metabolismo da célula para síntese de novas moléculas de ácidos nucléicos e proteínas.

4- Maturação: montagem da partícula viral  no citoplasma (RNA) ou núcleo (DNA) da célula hospedeira.

5- Liberação: vírions são translocados para células vizinhas por meio de plasmodesmas (movimento célula-a-célula) podendo atingir o floema (movimento sistêmico).

Como os vírus se locomovem na planta?

Vocês viram que os vírus podem entrar na célula por meio de ferimentos ou vetores. Uma vez na dentro da célula os vírus podem se distribuir a curta (movimentação célula-a-célula) e longas distâncias (movimentação sistêmica via floema).

Movimento célula-a-célula: o vírus replica em associação com o retículo endoplasmático (RE), posteriormente uma proteína chamada de "proteína de movimento" (MP) irá se associar ao RE, direcionando o RNA viral para os plasmodesmas. A proteína MP aumenta o limite de exclusão dos plasmodesmas permitindo a passagem do RNA viral.

Movimento sistêmico: depois que os vírus caem no floema seu transporte segue o fluxo normal de fotoassimilados.

Como ocorre a transmissão de vírus?

... Recordando: transmissão é ação da transferência do vírus de um hospedeiro doente para outros sadios.

Tipos de transmissão:

1- Sementes e pólen : A semente infectada pode ser importante fonte de inóculo para epidemias. Esse tipo de transmissão pode levar a disseminação do vírus a longa distância, devido ao comércio nacional e internacional de semente. No entanto, os vírus de plantas, em sua maioria, não são transmitidos dessa forma. Mas isso não significa a falta de importância desse tipo de transmissão. Por ex., na Califórnia, o LMV, transmitido pelas sementes de alface, causará perdas de 50% quando presentes em sementes na ordem de uma semente infectada em 30.000.

2- Material propagativo: Em muitas culturas propagadas vegetativamente, vírus de plantas pode ser facilmente transmitidos no material utilizado na propagação. Esse tipo de transmissão é particularmente importante em frutíferas e em culturas como a batata, o morango e o alho.

3- Cuscuta spp.: Plantas do gênero Cuscuta (popularmente conhecida como corda-de-viola) não possuem folhas e não sintetizam clorofila. Essas plantas são parasitas de outros vegetais, removendo nutrientes do hospedeiro por meio dos seus haustórios. Caso a Cuscuta parasite duas plantas e uma delas estiver infectada pelo vírus ela poderá ser capaz de transmitir o vírus para outras plantas sadias.

4- Vetores: A grande maioria dos vírus de plantas é transmitida por meio de vetores. Embora a transmissão por insetos seja a de maior importância, algumas viroses de relevância econômica podem ser transmitidas por outros tipos de organismos, como fungos, ácaros e nematóides.


Relacionamento vírus-vetor




Como controlar as viroses de plantas?

ATENÇÃO: Antes de estabelecer estratégias de controle é preciso identificar corretamente o vírus, conhecer o típo de transmissão do vírus na planta, conhecer os hospedeiros e o ambiente

Existem várias estratégias de controle para fitoviroses. Vejam algumas delas:

1- Uso de materiais propagativos sadios (livres de vírus): sementes e órgãos de propagação sadios.

2- Eliminação de possíveis fontes de inóculos: consiste na eliminação de plantas doentes pelo rouguing ou erradicação.

3- Medidas de higiene: tratamento de implementos agrícolas com produtos químicos (Por ex. Hipoclorito de sódio 0,25%). 

4- Modificação nos procedimentos de plantio: ter um período livre com a cultura, mudança da data de plantio, evitar plantio escalonado e sequenciais.

5- Repelentes reflexivos: utilizados para repelir os vetores da plantação (por ex. utilização de casca de arroz no solo, plásticos coloridos, plantas atrativas para os vetores).

6- Barreiras físicas: consiste na interposição de uma barreira física para que os vetores não tenham contato com as plantas (por ex. telados).

7- Controle químico de vetores: utilizados para vírus com relacionamento circulativo e ciruculativo-propagativo.

8- Pré-imunização: consiste na imunização da planta com estirpes fracas do vírus para que ela se proteja da estirpe forte.

9- Uso de variedades resistentes

10- Transgenia



Viroides


Vocês viram que os vírus são muuuito pequenos sendo apenas visualizados por meio de um microscópio eletrônico. Os viroides são ainda mais pequenos. São os menores microrganismos capazes de se replicar no interior de uma célula. Considerados os menores patógenos de plantas, são constituídos por um minúsculo RNA de fita simples, circular, com tamanho que oscila entre 250 e 350 nucleotídeos (10 vezes menores que a maioria dos genomas dos menores vírus de plantas conhecidos).

Composição de um viroide

Eles não codificam proteínas e, diferentemente dos vírus, não possuem capa proteica, sendo totalmente dependentes da maquinaria transcricional da célula do hospedeiro para cumprir as diferentes etapas do seu ciclo infeccioso que inclui: replicação, movimentação e patogênese.

Transmissão de viroides

Os viroides são transmitidos naturalmente por:

1- Contato - ferramentas contaminadas

2- Propagação vegetativa

3- Semente ou pólen

IMPORTANTE: Não há vetores conhecido na transmissão de viroides em plantas!


Doenças causadas por viroides


- Afilamento do tubérculo da batata

Potato spindle viroid - PSTVd (Praga quarentenária no Brasil)


- Cadang-Cadang

Coconut cadang-cadang viroid - CCVd (Praga quarentenária no Brasil)


- Exocorte dos citros

Citrus exocortis viroid - CEVd