Aula 6- Etiologia

Olá pessoal,

Etiologia é uma palavra de origem grega, aetia = causa + logos = estudo. Em Fitopatologia, corresponde à parte que estuda as causas das doenças de plantas e tem como objetivo o estabelecimento de medidas corretas de controle. Patógeno é qualquer organismo capaz de causar doença infecciosa em plantas, ou seja, fungos, bactérias, vírus, viróides, nematóides e protozoários. Patogenicidade é a capacidade que um patógeno possui, de associando-se ao hospedeiro, causar doença.

TESTE DE PATOGENICIDADE

Quando um organismo é encontrado associado a uma planta doente, se for conhecido ou registrado anteriormente, é identificado com a ajuda de literatura. Entretanto, se for um organismo desconhecido, pelo menos para tal planta, para confirmá-lo ou descartá-lo como agente causal da doença, é necessária a realização do teste de patogenicidade.

O estabelecimento da relação causal entre uma doença e um microrganismo só pode ser confirmado após o cumprimento de uma série de etapas, conhecida por Postulados de Koch, desenvolvidos por Robert Koch (1881) para patógenos humanos e adaptados posteriormente para Fitopatologia, constituindo o teste de patogenicidade.

1. Associação constante patógeno hospedeiro: um determinado microrganismo deve estar presente em todas as plantas de uma mesma espécie que apresentam o mesmo sintoma. Em outras palavras, deve-se poder associar sempre um determinado sintoma a um patógeno particular.

2. Isolamento do patógeno: o organismo associado aos sintomas deve ser isolado da planta doente e multiplicado artificialmente.

3. Inoculação do patógeno e reprodução dos sintomas: a cultura pura do patógeno, obtida anteriormente, deve ser inoculada em plantas sadias da mesma espécie que apresentou os sintomas inicias da doença e provocar a mesma sintomatologia observada anteriormente.

4. Reisolamento do patógeno: o mesmo organismo deve ser isolado das plantas submetidas à inoculação artificial. Se todas as etapas acima forem cumpridas, o organismo isolado pode ser considerado como o agente patogênico, responsável pelos sintomas observados.

Os testes de patogenicidade são realizados, geralmente, em casa-de-vegetação para plantas, e em laboratório para partes de plantas como

estacas, frutos, tubérculos e legumes.

CLASSIFICAÇÃO DOS PATÓGENOS

Parasitismo é um fenômeno extremamente complexo, sendo delineado em vários níveis. Baseado nesses aspectos, existem várias classificações para patógenos de plantas, entretanto, simplificadamente eles podem ser

agrupados em:

· Parasitas obrigados: são aqueles que vivem às custas do tecido vivo do hospedeiro. Não são cultivados em meio de cultura. Ex: fungos causadores de míldios, oídios, ferrugens e carvões; vírus, viróides, nematóides e algumas bactérias.

· Saprófitas facultativos: são aqueles que vivem a maioria do tempo ou a maior parte de seu ciclo de vida como parasitas, mas em certas circunstâncias, podem sobreviver saprofiticamente sobre matéria orgânica morta. Podem ser cultivados em meio de cultura. Ex: fungos causadores de manchas foliares, como Alternaria spp., Colletotrichum spp. e Cercospora spp.

· Parasitas facultativos: são aqueles que normalmente se desenvolvem como saprófitas, mas que são capazes de passar parte, ou todo o seu ciclo de desenvolvimento como parasitas. São facilmente cultivados em meio de cultura. Ex: fungos como Rhizoctonia solani e Sclerotium rolfsii.

· Parasitas acidentais: são aqueles organismos saprófitas que em determinadas condições (Ex.:planta com estresse) podem exercer o

parasitismo. Ex: Pseudomonas fluorescens causando podridão em alface.

Em geral, os parasitas obrigados e facultativos diferem entre si pela forma como atacam as plantas hospedeiras e obtém seus nutrientes a partir destas. Nos parasitas obrigados, a colonização é, geralmente, intercelular; enquanto que nos facultativos ela é, na maioria das vezes, intracelular.

Em virtude das diferenças de parasitismo, o teste de patogenicidade através dos Postulados de Koch apresenta particularidades para parasitas

facultativos e obrigados. No caso de parasitas facultativos, o teste de patogenicidade segue os postulados descritos previamente, enquanto no

caso de parasitas obrigados somente dois postulados podem ser aplicados:

1.       Associação constante patógeno hospedeiro: um determinado microrganismo deve estar presente em todas as plantas de uma mesma espécie que apresentam o mesmo sintoma.

2.       Inoculação do patógeno e reprodução dos sintomas: extrato de folhas doentes (no caso de vírus) ou suspensão de esporos ou esporângios (no caso de fungos causadores de ferrugens, carvões, oídios e míldios) deve ser inoculado em plantas sadias da mesma espécie que apresentou os sintomas iniciais da doença e provocar a mesma sintomatologia observada anteriormente.

DENOMINAÇÃO DOS PATÓGENOS

O nome genérico é escrito com inicial maiúscula e grifado. O nome especifico é escrito com inicial minúscula e grifado. Os nomes subespecíficos como: patovar (pv.), subespécie (subsp.), variedade (var.) e forma specialis (f.sp.)

também são escritos com inicial minúscula e grifados. O grifo poderá ser substituído por letra em itálico ou negrito. O nome genérico deverá ser abreviado a partir da segunda citação em texto científico. O nome do autor ou autores que classificaram a espécie deve ser citado, toda vez que a mesma for escrita pela primeira vez, em qualquer texto científico, podendo ser abreviados. O termo spp. = varias espécies e sp. = espécie desconhecida.

Exemplos:

Colletotrichum gloeosporioides Penz.

Fusarium oxysporum f.sp. vasinfectum (Atk.) Snyder & Hansen

Uromyces phaseoli var. typica Arth.

Erwinia carotovora subsp. atroseptica (van all) Dye

Xanthomonas campestris pv. campestris (Pammel) Dowson

Cercospora sp.

Pseudomonas spp.

Aula prática 5- Preparo de câmara úmida e técnicas de isolamento

Na aula prática dessa semana vocês aprenderam a preparar câmara úmida para o desenvolvimento de fitopatógenos na superfície da planta hospedeira e métodos de isolamentos de microrganismos.

1-Câmara úmida

Objetivo: expor o material vegetal a um ambiente úmido para que ocorra o desenvolvimento das estruturas do patógeno na superfície da lesão.

Qualquer parte da planta (folha, flores, ramos, etc) pode ser acondicionada em um recipiente (sacos plásticos, caixa plástica, placa de Petri, etc) fechado contendo um algodão ou papel umedecido com água. O interior do recipiente ficará úmido e assim estimulará o crescimento das estruturas do patógeno na lesão do material vegetal. O período de acondicionamento do material vegetal dentro da câmara úmida pode variar, no entanto, na maioria dos casos, 24 horas é suficiente para estimular o desenvolvimento das estruturas.

Observação: A câmara úmida é utilizada para exteriorizar as estruturas de fungos.

2-Métodos de isolamento de fungos fitopatogênicos

        

Consiste na obtenção do patógeno em cultura pura a partir de tecidos doentes do hospedeiro, solo ou substrato.

Os fungos fitopatogênicos raramente ocorrem isolados na natureza, em seu habitat natural, obrigando-nos quando queremos estudar um organismo isoladamente, algumas, vezes até mesmo para identificá-lo, recorrer a técnicas especiais para isolá-lo de outros organismos contaminantes.

Antes de isolar um organismo, particularmente em se tratando de material vegetal doente, os tecidos devem ser examinados para ver se há presença de estruturas fúngicas no órgão vegetal lesionado. Se estes apresentarem de estruturas é aconselhável identificá-lo em seu habitat natural, visto que muitos fungos, diante de substrato rico em nutrientes, podem levar muito tempo para produzir estruturas que possibilitem indentificá-los.

Uma planta doente possui microflora composta do parasita primário (agente causal da doença) e de organismos saprofíticos. Para isolar o agente patogênico, em cultura pura, é necessário separa-lo da microflora saprofítica, através de técnicas que favoreçam seu desenvolvimento, em detrimento do crescimento dos outros. Existem diversos métodos com tal propósito, os quais variam segundo a natureza do agente patogênico bem como dos tecidos vegetais afetados.

 Em todos os métodos faz-se necessário conservar a maior assepsia, possível para evitar contaminações externas que possam ocasionar o fracasso das investigações. Deste modo, flambar alças e agulhas de platina, placas de Petri, tubos de ensaio, bisturis, pinças, etc., com ou sem álcool é imprescindível; a mesa de trabalho e a câmara de fluxo laminar também devem ser desinfestados, preferencialmente com álcool a 70 %.

 - Escolha dos tecidos infectados; o isolamento deve ser feito de tecidos apresentando os sintomas característicos da doença. Pequenos fragmentos de tecido da região limítrofe entre a área lesionada e a área sadia devem ser retirados da planta doente, pois é nestas áreas que o patógeno se encontra em franca atividade. Áreas necróticas, no centro das lesões, normalmente contém alta população de saprófitas e devem ser evitadas.

- Desinfestação superficial dos tecidos; de um modo geral, é realizada molhando-se os tecidos em álcool 50 – 70% por 30 – 60 segundos (para quebrar a tensão superficial e expor o tecido com o hipoclorito) seguido de tratamento com hipoclorito de sódio (1 a 2%) de princípio ativo, durante 1 a 5 minutos. Quando os tecidos são volumosos, espessos ou suculentos (raízes grossas,folhas e frutos carnosos, troncos, etc.) e o patógeno atinge camadas profundas, a superfície dos tecidos pode ser desinfestada aumentando a concentração do desinfestante, o tempo de exposição, ou ambos. Se, por outro lado, os tecidos são delicados e as estruturas do patógeno pouco profundas há o risco de matá-lo com a desinfestação, sendo preferível lavar demoradamente a superfície dos tecidos com água destilada, esterilizada e então remover a epiderme e cultivar os tecidos subjacentes, contendo o patógeno.

Métodos de isolamentos:

- Isolamento direto: é uma prática útil no caso em que o patógeno apresenta frutificações (conídios, picnídios, peritécios, apotécios, acérvulos, etc) ou quando não as apresenta mas é possível obtê-las, deixando os órgãos infectados em câmara úmida durante 1 a 2 dias. Os órgãos com as lesões contendo as estruturas são observados sob microscópio e, com auxílio de uma agulha, estilete ou microbisturí devidamente flambados, esfriados e umedecidos no meio de cultura que iremos utilizar, recolhemos algumas estruturas (frutificações) e as transportamos para os tubos de ensaio ou placas de Petri com o meio.

 Isolamento direto de fungo a partir de suas estruturas formadas na superfície do hospedeiro

- Isolamento indireto: é utilizado quando se tem o material muito contaminado por organismos secundários e seja difícil a sua desinfestação superficial, ou quando se pretenda fazer uma separação preliminar do patógeno, antes de isolá-lo. Fragmentos são retirados da área limítrofe entre tecido sadio e lesionado e posteriormente desinfestados em álcool 70% durante 30 -60 segundos, hipoclorito de sódio durante 30 segundos e lavagem em água destilada para retirada do excesso do hipoclorito. Os fragmentos desinfestados são transferidos para o meio de cultura e posterior armazenamento para crescimento da colônia.

Isolamento indireto de fungo a partir de fragmentos do tecido lesionado do hospedeiro

Observação: o isolamento direto diminui as chances de contaminações quando comparado ao isolamento indireto.

Aula prática 5- Preparo de câmara umida e técnicas de isolamento

Na aula prática dessa semana vocês aprenderam a preparar câmara úmida para o desenvolvimento de fitopatógenos na superfície da planta hospedeira e métodos de isolamentos de microrganismos.

1-Câmara úmida

Objetivo: expor o material vegetal a um ambiente úmido para que ocorra o desenvolvimento das estruturas do patógeno na superfície da lesão.

Qualquer parte da planta (folha, flores, ramos, etc) pode ser acondicionada em um recipiente (sacos plásticos, caixa plástica, placa de Petri, etc) fechado contendo um algodão ou papel umedecido com água. O interior do recipiente ficará úmido e assim estimulará o crescimento das estruturas do patógeno na lesão do material vegetal. O período de acondicionamento do material vegetal dentro da câmara úmida pode variar, no entanto, na maioria dos casos, 24 horas é suficiente para estimular o desenvolvimento das estruturas.

Observação: A câmara úmida é utilizada para exteriorizar as estruturas de fungos.

2-Métodos de isolamento de fungos fitopatogênicos

        

Consiste na obtenção do patógeno em cultura pura a partir de tecidos doentes do hospedeiro, solo ou substrato.

Os fungos fitopatogênicos raramente ocorrem isolados na natureza, em seu habitat natural, obrigando-nos quando queremos estudar um organismo isoladamente, algumas, vezes até mesmo para identificá-lo, recorrer a técnicas especiais para isolá-lo de outros organismos contaminantes.

Antes de isolar um organismo, particularmente em se tratando de material vegetal doente, os tecidos devem ser examinados para ver se há presença de estruturas fúngicas no órgão vegetal lesionado. Se estes apresentarem de estruturas é aconselhável identificá-lo em seu habitat natural, visto que muitos fungos, diante de substrato rico em nutrientes, podem levar muito tempo para produzir estruturas que possibilitem indentificá-los.

Uma planta doente possui microflora composta do parasita primário (agente causal da doença) e de organismos saprofíticos. Para isolar o agente patogênico, em cultura pura, é necessário separa-lo da microflora saprofítica, através de técnicas que favoreçam seu desenvolvimento, em detrimento do crescimento dos outros. Existem diversos métodos com tal propósito, os quais variam segundo a natureza do agente patogênico bem como dos tecidos vegetais afetados.

 Em todos os métodos faz-se necessário conservar a maior assepsia, possível para evitar contaminações externas que possam ocasionar o fracasso das investigações. Deste modo, flambar alças e agulhas de platina, placas de Petri, tubos de ensaio, bisturis, pinças, etc., com ou sem álcool é imprescindível; a mesa de trabalho e a câmara de fluxo laminar também devem ser desinfestados, preferencialmente com álcool a 70 %.

 - Escolha dos tecidos infectados; o isolamento deve ser feito de tecidos apresentando os sintomas característicos da doença. Pequenos fragmentos de tecido da região limítrofe entre a área lesionada e a área sadia devem ser retirados da planta doente, pois é nestas áreas que o patógeno se encontra em franca atividade. Áreas necróticas, no centro das lesões, normalmente contém alta população de saprófitas e devem ser evitadas.

- Desinfestação superficial dos tecidos; de um modo geral, é realizada molhando-se os tecidos em álcool 50 – 70% por 30 – 60 segundos (para quebrar a tensão superficial e expor o tecido com o hipoclorito) seguido de tratamento com hipoclorito de sódio (1 a 2%) de princípio ativo, durante 1 a 5 minutos. Quando os tecidos são volumosos, espessos ou suculentos (raízes grossas,folhas e frutos carnosos, troncos, etc.) e o patógeno atinge camadas profundas, a superfície dos tecidos pode ser desinfestada aumentando a concentração do desinfestante, o tempo de exposição, ou ambos. Se, por outro lado, os tecidos são delicados e as estruturas do patógeno pouco profundas há o risco de matá-lo com a desinfestação, sendo preferível lavar demoradamente a superfície dos tecidos com água destilada, esterilizada e então remover a epiderme e cultivar os tecidos subjacentes, contendo o patógeno.

Métodos de isolamentos:

- Isolamento direto: é uma prática útil no caso em que o patógeno apresenta frutificações (conídios, picnídios, peritécios, apotécios, acérvulos, etc) ou quando não as apresenta mas é possível obtê-las, deixando os órgãos infectados em câmara úmida durante 1 a 2 dias. Os órgãos com as lesões contendo as estruturas são observados sob microscópio e, com auxílio de uma agulha, estilete ou microbisturí devidamente flambados, esfriados e umedecidos no meio de cultura que iremos utilizar, recolhemos algumas estruturas (frutificações) e as transportamos para os tubos de ensaio ou placas de Petri com o meio.

 Isolamento direto de fungo a partir de suas estruturas formadas na superfície do hospedeiro

- Isolamento indireto: é utilizado quando se tem o material muito contaminado por organismos secundários e seja difícil a sua desinfestação superficial, ou quando se pretenda fazer uma separação preliminar do patógeno, antes de isolá-lo. Fragmentos são retirados da área limítrofe entre tecido sadio e lesionado e posteriormente desinfestados em álcool 70% durante 30 -60 segundos, hipoclorito de sódio durante 30 segundos e lavagem em água destilada para retirada do excesso do hipoclorito. Os fragmentos desinfestados são transferidos para o meio de cultura e posterior armazenamento para crescimento da colônia.

Isolamento indireto de fungo a partir de fragmentos do tecido lesionado do hospedeiro

Observação: o isolamento direto diminui as chances de contaminações quando comparado ao isolamento indireto.